粘杆菌素ELISA检测试剂盒说明书

              粘杆菌素快速检测试剂盒使用说明书

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物粘杆菌素类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争粘杆菌素类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物粘杆菌素类药物的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物粘杆菌素类药物的含量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 1ppb

检测时间：45min

样本检测下限：

组织样本（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼、鸡蛋）：

………………………………………………5ppb

牛奶、蜂蜜…………………………………20ppb

反应率：

粘杆菌素 …………………………………………100%  

多粘菌素B ………………………………………95%  

 样本回收率：

组     织   …………………………………… 85%±20%

牛奶、蜂蜜  ………………………………  80%±20%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm

3、 酶标记物       7ml………………………红色帽

4、 抗体工作液   7ml ………………………绿色帽

5、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

7、 终  止  液     7ml  ……………………黄色帽

8、 20X浓缩洗涤液40 ml  ………………白色帽

9、 2X 浓缩复溶液   50ml ·………………蓝色帽 

【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道 20μl～200μl、单道100μl～1000μl多道 30～300 μl

试           剂：乙腈、正己烷、氯化钠

【实验前溶液配制】

配液1：复溶工作液

               2X复溶液在使用前请按1：1稀释

            （1份浓缩复溶液+1份去离子水）

配液2：洗涤液

              将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用蒸馏水稀释

             20×浓缩洗涤液在使用前请按1：19稀释（1份     

             浓缩洗涤液+19份去离子水）（可按需配置）

【样本前处理步骤】   

样本前处理须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。

（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

  样本前处理方法

（A）动物组织样本、蛋类

1、 用均质器均质样本；称取2±0.05g样本于50ml离心管中，加入0.5g氯化钠，再加入5ml乙腈，用振荡器振荡5分钟；4000转/分以上,室温离心10分钟；

2、 取上清液2.5ml至干净玻璃试管中，于56℃水浴下氮气/空气吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min。

（注：如出现乳化现象；可置于80度水浴十分钟后再次离心）

4、 取50 µl下层相与取200 µl稀释后的复溶液强烈振荡混合30s后，取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：5

（B）牛奶

1、取1ml牛奶样本于离心管中，在3000r/min，4℃离心10min，

      去除上层脂肪。

2、取50ul上清液，加入950ul 稀释后的复溶液混匀，混合30s。

3、取50µl液体用于分析。

     样本稀释倍数：20倍

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配制标准品应用液；现配现用。

标准品6：浓度为81ppb    

取40.5µl高浓度标准品7溶液用460µl稀释好的复溶液稀释并混合均匀

标准品5：浓度为  27ppb

取100µl标准品6用200µl稀释好的复溶液稀释  

标准品4：浓度为  9ppb

取100µl标准品5用200µl稀释好的复溶液稀释      

标准液3：浓度为  3ppb

取100µl标准品4用200µl稀释好的复溶液稀释

标准品2：浓度为  1ppb

取100µl标准品3用200µl稀释好的复溶液稀释

标准品1：浓度为  0ppb

直接使用已稀释好的复溶液作为标准品1即0ppb 

4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶标记物50µl/孔和抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含粘杆菌素的含量成负相关。

1、粗略判定：

    用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；1ppb为1.320；3ppb为1.030；9ppb为0.660； 27ppb为0.389；81ppb为0.198。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb； 样本2的浓度范围是3ppb-9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中粘杆菌素实际浓度。           

2、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以粘杆菌素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中粘杆菌素实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

                   1                   3                    9                    27                  81    

粘杆菌素(ppb) [µg/kg]

图1：粘杆菌素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

 %CV 

            0       1        3        9       27     81

                   粘杆菌素(ppb) [µg/kg]

           图2：粘杆菌素检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出粘杆菌素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应粘杆菌素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。