呋喃西林代谢物ELISA试剂盒说明书

                      呋喃西林代谢物检测试剂盒

使用说明书

【产品简介】

硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。呋喃西林在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。

呋喃西林代谢物快速检测试剂盒具有方便、快速、灵敏等特点，适用于动物组织（水产、鸡、猪、牛）、牛奶等大批量样品中的呋喃西林代谢物快速检测。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的AHD，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的AHD和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的AHD含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。

【试剂盒技术指标】   

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.05ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

水产品、动物组织……………………… 0.3ppb

蜂蜜……………………………………… 0.3ppb

参考标准GB/T 21311-2007 检测下限为0.5ppb

交叉反应率：

呋喃西林代谢物……………………………… 100%

呋喃妥因代谢物………………………………﹤0.1%

呋喃它酮代谢物………………………………﹤0.1%

呋喃唑酮代谢物………………………………﹤0.1%

回收率：

组织、肝脏………………………………90%±15%

蜂蜜、牛奶、肠衣………………………80%±15%

【试剂盒组成】   

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高浓度标准品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶标记物      7ml………………… 红色帽

5、 抗体工作液  7ml………………… 蓝色帽

6、 底物A液     7 ml………………… 棕色帽

7、 底物B液     7 ml ………………… 黑色帽

8、 终止液     　7 ml ………………… 黄色帽

9、 20×浓缩洗涤液40 ml…………… 白色帽

10、 2×浓缩复溶液 50 ml …………… 蓝色帽

11、 衍生化试剂　 10ml ………………黑色帽

【所用仪器、试剂】   

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道250µl

试          剂：氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、磷酸氢二钾、浓HCl

【实验前溶液配制】

配液1、将2×浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照 1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  称11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加去离子水溶解定容至500ml。

配液4、1M HCl溶液

取8.6ml浓HCl加去离子水定溶至100ml。

配液5、1M NaOH溶液

               取4g NaOH加去离子水定容至100ml。

【样本前处理方法】   

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、猪、牛、羊、兔、鱼、虾等。

（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（3）实验前须检查各种实验器具是否干净，必要时对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤：

该方法为氯霉素和硝基呋喃类四项同时检测的五合一前处理方法；用本方法制备出的样品提取溶液可以直接同时应用于本公司研发的氯霉素和呋喃唑酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物检测试剂盒。(备注：使用该五合一前处理方法检测氯霉素时，因存在一定的干扰；样本检测下限为0.3ppb）

(a) 水产、组织、蜂蜜

1、 取2±0.05g均质样本样本，加入 4ml的去离子水，0.5ml1M HCl和100µl衍生化试剂，充分振荡。

2、 置于37℃恒温箱孵育过夜（大约16h）或90℃水浴中孵育20min；

3、 分别加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充

          分振荡2min；

4、 在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心5min。

5、 取出2.5ml上层清亮液体到另一洁净离心管中，于65℃氮气/空

气吹干。

6、 用1ml正己烷溶解干燥物，加入1ml已稀释好的复溶液充分混合

30s；在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心5min。

7、 取50µl下层用于分析。

样本稀释倍数：1

(b) 特殊样本(畜禽产品组织、肝脏、肠衣、油炸食品、混合肉馅、熟食等)的处理方法

1、 取2±0.05g的均质样本于50ml离心管中，6ml的去离子水，充分振荡2min，加入5ml正己烷，充分混合震荡3min,4000r/min离心10min。

2、 弃除上层有机相液体，吸取4ml下层清澈液体于另一个50ml离心管中，加0.5ml1M HCl和100µl衍生化试剂，充分振荡。

3、 置于37℃过夜孵育（大约16h）或90℃水浴中孵育20min；

4、 分别加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振荡2min；在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心5min。

5、 取出2.5ml上层清亮液体到另一洁净离心管中，于65℃氮气  /空气吹干。

6、 用1ml正己烷溶解干燥物，加入1ml已稀释好的复溶液充分混合30s，在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心5min。

7、 取出50µl下层用于分析。

        样本稀释倍数：2

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔,然后加入抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸垫好后拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与AHD的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AHD浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.239，样品2的吸光度值为1.1270，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.821；0.05ppb为1.464；0.15ppb为1.163； 0.45ppb为0.677； 1.35ppb为0.297； 4.05ppb为0.104。则样品1的浓度范围1.35ppb-4.05ppb；样品2的浓度范围0.15ppb-0.45ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以AHD标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

         0.05      0.15      0.45       1.35       4.05

AHD(ppb) [µg/kg]

图1： 呋喃西林代谢物检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

          0      0.05    0.15    0.45    1.35     4.05

                                        SEM(ppb) [µg/kg]

        图2：呋喃西林代谢物检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出呋喃西林代谢物检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应呋喃西林浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】  

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。