呕吐毒素ELISA检测试剂盒说明书

                 呕吐毒素快速检测试剂盒

使用说明书

【产品简介】

  呕吐毒素是一类真菌毒素，它具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中呕吐毒素的毒性、致癌性、污染频率均居于首wei。薄层色谱一直是检测呕吐毒素常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用呕吐毒素 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中呕吐毒素残留。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物呕吐毒素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争呕吐毒素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物呕吐毒素的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物呕吐毒素的含量。

【试剂盒技术指标】   

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 5ppb

检测时间： 75min

样本检测下限：

牛奶……………………………………………50ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………5ppb

饲料、谷物、玉米、花生、豆类、果蔬……………500ppb

反应率：

呕吐毒素……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

饲    料…………………………………………75±10%

【试剂盒组成】   

1.     微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条

2.   标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、5ppb、15ppb、45pp、135ppb、405ppb

3.    酶标记物       12ml…………………………红色帽

4.    抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

5.    底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

6.    底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

7.    终 止 液          7ml…………………………黄色帽

8.    20X浓缩洗涤液40ml…………………… 白色帽

9.  2X浓缩复溶液液50 ml………………… 蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

仪          器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/

                     氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试           剂：甲醇、正己烷、滤纸

【实验前溶液配制】

配液1、样品提取液：70%甲醇溶液

        30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制

         备70％甲醇溶液。

配液2、将2X浓缩复溶液液用去离子水按照1：1稀

             释（1 份浓缩样品液+1份去离子水）用于样品的

             稀释。

配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19

              稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量

              配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）生鲜牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl复已稀释好的溶液液混合30s；

     2、取50µl用于检测检测分析。

          样本稀释倍数:10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、称取5g样品于50ml离心管中，加入10ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的复溶液液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

     样本稀释倍数:1

（C）饲料、谷物、玉米、花生、豆类、果蔬

1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的提取溶液混合；强力振荡5分钟。

2、用Whatman No.滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与已稀释好的复溶液液950ul 充分混合30s

      取50ul进行检测分析。

          样本稀释倍数:100

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、  显色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与呕吐毒素的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；5ppb为1.350；15ppb为1.030；45ppb为0.660； 135ppb为0.379；4050ppb为0.198。则样本1的浓度范围是135ppb-4050ppb； 样本2的浓度范围是15 ppb-45ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

  5          15        45         135     405

呕吐毒素(ppb) [µg/kg]

图1：呕吐毒素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

      0          5     15       45     135    405     

呕吐毒素 (ppb) [µg/kg]

图2：呕吐毒素检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出呕吐毒素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应呕吐毒素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

  有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。