黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒说明书

   黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒

使用说明书

【产品简介】

黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素M1（AFM1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首wei。薄层色谱一直是检测黄曲霉毒素常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素M1残留。参考国家标准GB/T 5009.22-2003。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉毒素M1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉毒素M1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素M1的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉毒素M1的含量。

【试剂盒技术指标】   

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.025ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

牛奶……………………………………………0.25ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb

饲料……………………………………………2.5ppb

反应率：

黄曲霉毒素M1……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

饲    料…………………………………………75±10%

【试剂盒组成】   

1、 微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条

1、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb

2、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶） 10ppb

2、 酶标记物      7ml…………………………红色帽

3、 抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

4、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

5、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、 终 止 液          7ml…………………………黄色帽

7、 20X浓缩洗涤液40ml…………………… 白色帽

8、 2X浓缩复溶液50 ml…………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

仪          器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/

                     氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试           剂：甲醇、正己烷、滤纸

【实验前溶液配制】

配液1、50%甲醇溶液：

 50ml蒸馏水或去离子水和50ml纯甲醇混合制备50％甲醇

溶液。

配液2、将2×浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1份浓缩复

溶液+1份去离子水）用于样品的稀释。

配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19

稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量

配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   

处理任何样本时，都必须注意：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同试剂时要更换吸头

（2）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）生鲜牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl已经稀释后的复溶液混合30s；

     2、取50µl用于检测检测分析。

          样本稀释倍数:10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、称取5g样品于50ml离心管中，加入10ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml已经稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

     样本稀释倍数:1

（C）饲料

1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；强力振荡5分钟。

2、用Whatman No.滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与已经稀释后的复溶液950ul 充分混合30s

      取50ul进行检测分析。

          样本稀释倍数:100

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、  显色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉毒素M1的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含M1浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.248，样品2的吸光度值为1.021，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.821；0.025ppb为1.434；0.075ppb为1.163； 0.225ppb为0.767； 0.675ppb为0.298； 2.025ppb为0.106。则样品1的浓度范围0.675ppb-2.025ppb；样品2的浓度范围0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素M1的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素M1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素M1实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

       0.025     0.075       0.225     0.675     2.025

                    黄曲霉毒素M1(ppb) [µg/kg]

图1：黄曲霉毒素M1检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

         0      0.025    0.075     0.225   0.675   2.025

黄曲霉毒素M1 (ppb) [µg/kg]

图2：黄曲霉毒素M1检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出黄曲霉毒素M1检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉毒素M1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、批号见外包装。